IMMUNOGLOBULINES : REACTIONS ANTIGENE-ANTICORPS ET TESTS EXPERIMENTAUX POUR LA DETECTION DE CES RÉACTIONS

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INFECTIOUS DISEASE	BACTERIOLOGY	IMMUNOLOGY	MYCOLOGY	PARASITOLOGY	VIROLOGY
VIDEO LECTURE	IMMUNOLOGIE – CHAPITRE SEPT IMMUNOGLOBULINES : REACTIONS ANTIGENE-ANTICORPS ET TESTS EXPERIMENTAUX POUR LA DETECTION DE CES RÉACTIONS Gene Mayer, Ph.D. Emertius Professor of Pathology, Microbiology and Immunology University of South Carolina Denis Hudrisier, Ph.D. Centre national de la recherche scientifique (CNRS) · Institute of Pharmacology and Structural Biology Université de Toulouse

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LECTURE Male et al. Immunology 7ème édition pp 67-74
OBJECTIFS DU COURS Décrire la nature des réactions Ag-Ac Comparer et faire la différence entre affinité et avidité des anticorps Donner les bases de la spécificité et cross-réactivité des anticorps Discuter les principes des tests communs pour analyser les réactions Ag-Ac Figure 1	NATURE DES REACTIONS ANTIGENE-ANTICORPS Concept clé/serrure Le site de liaison de l’anticorps est situé dans la partie Fab de la molécule et formé par la mise en commun des régions hypervariables (CDR) des chaînes lourdes et légères. Les études de cristallographie aux rayons-X ont révélé que le déterminant antigénique se nichait dans une gorge formée par le site de liaison de l’anticorps comme illustré dans la Figure 1. Le concept des réactions antigène-anticorps peut donc être assimilé à celui d’une clé (l’antigène) qui s’insère dans une serrure (le site anticorps). Liaisons non-covalentes Les liaisons qui maintiennent l’antigène fixé dans le site anticorps sont de nature non-covalente. Cela inclue des liaisons hydrogènes, des liaisons électrostatiques, des forces de Van der Waals et des liaisons hydrophobes. De multiples liaisons entre l’antigène et l’anticorps assurent une interaction stable entre ces deux molécules. Réversibilité Comme les réactions antigène-anticorps se produisent par l’intermédiaire de liaisons non-covalentes, elles sont par nature réversibles.
Mots-clés Affinité Avidité Spécificité Cross réactivité Agglutination Hémagglutination Agglutinines Titre Prozone Hémagglutination passive Test de Coomb direct Test de Coomb indirect Inhibition d’hémagglutination Point d’équivalence Excès d’anticorps Excès d’antigènes Immunodiffusion radiale Immunoélectrophorèse Contre- immunoélectrophorèse Radioimmuno-essai (RIA) Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) RIA/ELISA par compétition RIA/ELISA non-compétitif Immunofluorescence Cytométrie en flux Fixation du complément Figure 2 Figure 3 Figure 4 Figure 5	AFFINITE ET AVIDITE Affinité L'affinité des anticorps est l'intensité de la réaction entre un déterminant antigénique unique et un seul site de liaison de l'anticorps. Il est la somme des forces d'attraction et de répulsion agissant entre le déterminant antigénique et le site de liaison de l'anticorps tel que représenté sur la Figure 2. L’affinité est la constante d'équilibre qui décrit la réaction antigène-anticorps, comme illustré dans la Figure 3. La plupart des anticorps ont une forte affinité pour les antigènes. Avidité L'avidité est une mesure de la force globale de la liaison d'un antigène possédant des déterminants antigéniques multiples avec des anticorps polyvalents. L’avidité est influencée à la fois par la valence de l'anticorps et la valence de l'antigène. L’avidité est supérieure à la somme des affinités différentes. Ceci est illustré dans la Figure 4. L’affinité fait donc référence à la force de liaison entre un déterminant antigénique unique et un site anticorps individuel alors que l'avidité fait référence à la force globale de la liaison entre les antigènes et les anticorps multivalents. SPECIFICITE ET CROSS-REACTIVITE Spécificité La spécificité fait référence à la capacité d’un site anticorps donné à réagir avec un seul déterminant antigénique ou encore à la capacité d’une population d’anticorps polyclonaux à réagir avec un seul antigène. En général, il y a un fort degré de spécificité dans une interaction antigène-anticorps. Les anticorps peuvent reconnaître des différences entre : La structure primaire d’un antigène La nature isomérique d’un antigène Les structures secondaires et tertiaires d’un antigène Cross-réactivité (ou réaction croisée) La cross-réactivité (encore appelée réaction croisée) fait référence à la capacité d’un site anticorps donné à réagir avec plus d’un déterminant antigénique ou encore à la capacité d’une population polyclonale d’anticorps à réagir avec plus d’un antigène. La Figure 5 illustre comment des réactions croisées peuvent se produire. Elles peuvent résulter de l’existence d’un épitope en commun entre l’antigène donnant lieu à la réaction croisée et celui ayant servi à l’immunisation ou encore de la reconnaissance d’un épitope possédant une structure similaire dans l’antigène cross-réactif et l’antigène immunisant (multispécificité). TESTS POUR LES RÉACTIONS ANTIGENE-ANTICORPS Facteurs affectant la mesure des réactions antigène-anticorps La seule façon de savoir si la réaction antigène-anticorps s’est produite est de disposer de moyens directs ou indirects pour détecter les complexes formés entre antigène et anticorps. La facilité avec laquelle il sera possible de détecter les réactions antigène-anticorps dépend de plusieurs facteurs. Affinité Plus l’affinité de l’anticorps pour l’antigène sera élevée et plus l’interaction sera stable. Ainsi, la détection de cette interaction sera facilitée. Avidité Les réactions entre les antigènes multivalents et les anticorps multivalents sont plus stables et sont donc plus facilement détectables.
Figure 6	Rapport molécuaire antigène/anticorps Le rapport moléculaire entre l’antigène et l’anticorps influence la détection des complexes antigène-anticorps car la taille des complexes formés dépend de la concentration de l’antigène et de l‘anticorps. Cette relation est illustrée dans la Figure 6. Nature physique de l’antigène La nature physique de l'antigène influence la façon de mesurer sa réaction avec l’anticorps. Si l'antigène est de nature particulaire, on recherche généralement une agglutination de l'antigène par l'anticorps. Si l'antigène est soluble, on privilégie la recherche d’une précipitation de l'antigène après la production de larges complexes antigène-anticorps insolubles.
Figure 7	Tests d’agglutination Agglutination/Hémagglutination Lorsque l’antigène est de nature particulaire, la réaction de l’anticorps avec l’antigène peut être détectée par des tests d’agglutination de l’antigène. Le terme d’agglutinine est utilisé pour décrire les anticorps qui agglutinent les antigènes particulaires. Quand l’antigène est un érythrocyte, on utilise le terme d’hémagglutination. Tous les anticorps peuvent théoriquement agglutiner des antigènes particulaires mais les IgM, en raison de leur valence élevée, sont de particulièrement bonnes agglutinines et on conclue souvent que l’anticorps est de classe IgM lorsque de fortes agglutinations sont détectées. Test qualitatif d’agglutination Les tests d’agglutination peuvent être utilisés de façon qualitative pour détecter la présence d’un antigène ou d’un anticorps. L’anticorps est mélangé avec un antigène particulaire et le test est positif si une agglutination de l’antigène particulaire se produit (Figure 7). Par exemple, les globules rouges d’un patient peuvent être mélangés avec des anticorps dirigés contre des antigènes définissant les groupes sanguins afin de déterminer le groupe sanguin d’une personne. Dans un autre exemple, le sérum d’un patient peut être mélangé avec des globules rouges de groupes sanguins bien définis afin de savoir s’il existe des anticorps dirigés contre tel ou tel groupe sanguin dans le sérum du patient.
Figure 8	Test quantitatif d’agglutination Les tests d’agglutination peuvent aussi être utilisés pour mesurer la quantité d’anticorps dirigés contre un antigène particulaire. Dans ces tests, des dilutions successives de l’échantillon dans lequel on souhaite déterminer la quantité d’anticorps sont mélangés à une quantité fixe de globules rouges ou de bactéries ou de tout antigène particulaire pertinent. La dilution la plus forte permettant d’avoir une agglutination est alors déterminée. Cette dilution est appelée le « titre » en anticorps. Les résultats sont présentés comme la réciproque de la dilution maximale donnant une agglutination visible. La Figure 8 montre un test quantitatif d’hémagglutination. Effet de la prozone. Occasionnellement, on n’observe pas d’agglutination aux fortes concentrations d’anticorps (c’est à dire aux premières dilutions) et celle-ci n’apparaît qu’à des dilutions plus fortes (voir par exemple le patient 6 dans la Figure 8). L’absence d’agglutination à forte concentration d’anticorps s’appelle « effet de prozone ». L’absence d’agglutination dans la prozone est due à un excès d’anticorps qui conduit à la formation de complexes trop petits pour être visibles sous la forme d’une agglutination.
	Applications des tests d’agglutination Détermination des groupes sanguins ou de la présence d’anticorps contre des antigènes de groupes sanguins. Diagnostique d’infections bactériennes Par exemple, l’augmentation du titre en anticorps dirigés contre une bactérie donnée indique qu’une infection par cette bactérie a eu lieu. N.B. une augmentation d’un facteur quatre du titre en anticorps contre une bactérie donnée est généralement retenue comme la limite significative pour s’assurer de l’augmentation du titre en anticorps. Considérations pratiques Bien que ce test soit facile à réaliser il donne seulement une information semi-quantitative.
Figure 9	Hémagglutination passive Les tests d’agglutination ne marchent qu’avec des antigènes particulaires. Toutefois, il est possible de recouvrir des érythrocytes avec un antigène soluble (par exemple un antigène viral, un polysaccharide ou un haptène) et d’utiliser les érythrocytes ainsi recouverts d’antigène dans des tests d’agglutination visant à rechercher la présence d’anticorps contre l’antigène soluble (Figure 9). Ces tests sont appelés « hémagglutination passive ». Les applications de ces tests se situent au niveau de la détection d’anticorps contre des antigènes solubles ou des antigènes viraux.
Figure 10	Test de Coomb (ou test « antiglobulines ») Test direct de Coomb Lorsque des anticorps se lient aux érythrocytes, il n'y a pas toujours d’agglutination. Ceci peut être dû au rapport antigène / anticorps (excès d'antigène ou excès d'anticorps ou, dans certains cas, présence de charges électriques sur les globules rouges qui empêchent la liaison transversale efficace des cellules entre elles nécessaire à l’agglutination). Ces anticorps qui se lient, mais ne provoquent pas d'agglutination des globules rouges sont parfois appelés anticorps incomplets. Cela ne signifie pas, comme on l’avait cru à un moment, que ces anticorps ont des structures différentes. Il s'agit plutôt d'une définition purement fonctionnelle. Afin de détecter la présence d'anticorps non agglutinants sur les globules rouges, on ajoute simplement un second anticorps dirigé contre l'immunoglobuline (anticorps) recouvrant les globules rouges. Cet anticorps secondaire anti-immunoglobuline peut maintenant agréger les globules rouges et conduire à l'agglutination. Ce test est illustré dans la Figure 10 et est connu sous le nom de Test direct de Coomb.
Figure 11	Test indirect de Coomb Quand il s’agit de savoir si un sérum contient des anticorps, même non agglutinants, dirigés contre des globules rouges particuliers, on utilise un test indirect de Coomb (Figure 11). Ce test est réalisé en incubant les globules rouges avec le sérum, puis en lavant les anticorps non liés et en ajoutant, finalement, le réactif secondaire (anticorps anti-immunoglobulines) pour agréger les cellules. Applications Les applications de ces tests incluent la détection d’anticorps anti-facteur rhesus (Rh). Les anticorps contre le facteur Rh n’agglutinent généralement pas les globules rouges. Ainsi les globules rouges d’un enfant Rh+ né d’une mère Rh- (possédant potentiellement des anticorps anti-Rh) peuvent être recouverts avec les anticorps maternels. Pour révéler cela, un test direct de Coomb peut-être réalisé. A l’inverse, pour savoir si la mère possède des anticorps anti-Rh dans son sérum, un test indirect de Coomb pourra être mis en oeuvre.
Figure 12	Inhibition d’hémagglutination Les tests d'agglutination peuvent être adaptés pour être utilisés avec des antigènes solubles. Ce test est appelé test d’inhibition de l'hémagglutination. Il est appelé inhibition de l'hémagglutination parce que l'on mesure la capacité d'un antigène sous forme soluble à inhiber l'agglutination de globules rouges portant le même antigène par des anticorps dirigés contre l’antigène. Dans ce test, une quantité fixe d'anticorps dirigés contre l'antigène en question est mélangé avec une quantité fixe de globules rouges portant le même antigène (voir plus haut le test d’hémagglutination passive). On inclue également dans le mélange différentes quantités de l'échantillon à analyser pour la présence de l'antigène. Si l'échantillon contient l'antigène, l'antigène soluble entre en compétition avec l'antigène immobilisé sur les globules rouges empêchant ainsi aux anticorps de se lier, ce qui se traduit par une inhibition de l'agglutination des globules rouges (voir Figure 12). En diluant l'échantillon, on peut mesurer la quantité d'antigène présente dans l'échantillon à tester par son titre. Ce test est généralement utilisé pour quantifier les antigènes solubles et est soumis aux mêmes considérations pratiques que le test d'agglutination.
Figure 13	Tests de précipitation Immunodiffusion radiale (test de Mancini) Dans l’immunodiffusion radiale, un anticorps est incorporé dans un gel d’agarose lorsque celui-ci est coulé et différentes dilutions d’antigènes sont placés dans des puits creusés dans l’agarose. Au fur et à mesure que l’antigène diffuse passivement depuis le puits dans lequel il est déposé, il réagit avec l’anticorps et, quand le point d’équivalence est atteint (c’est à dire quand les concentrations relatives en antigène et en anticorps permettent la formation de complexes antigènes-anticorps suffisamment gros pour précipiter), un arc de précipitation se forme comme illustré dans la Figure 13. Le diamètre de l’arc de précipitation formé est proportionnel au logarithme de la concentration en antigène puisque la quantité d’anticorps est constante. Ainsi, en testant différentes concentrations d’un antigène utilisé comme standard on peut générer une courbe étalon à partir de laquelle on peut déduire la concentration en antigène dans l’échantillon à tester. C’est donc un test quantitatif. Si plusieurs arcs de précipitation apparaissent, cela traduit le faut qu’il y a eu davantage qu’une interaction antigène/anticorps. Cela peut être dû à la présence d’un mélange d’antigènes ou d’anticorps. Ce test est utilisé classiquement en clinique pour déterminer les taux d’anticorps dans les échantillons biologiques provenant de patients.
Figure 14	Immunoélectrophorèse Dans l’immunoélectrophorèse, un mélange complexe d’antigènes est placé dans un puits creusé dans un gel d’agarose puis ce mélange est soumis à une électrophorèse permettant une séparation des antigènes en fonction de leur charge. Après l’électrophorèse, une rigole est creusée dans le gel et les anticorps y sont placés. Au fur et à mesure que les anticorps diffusent passivement dans le gel, des lignes de précipitation se forment dans la zone d’équivalence indiquant que la réaction antigène/anticorps a eu lieu (voir Figure 14). Ces tests sont utilisés pour l’analyse qualitative de mélanges complexes d’antigènes (une évaluation brute quantitative étant accessible par la mesure de l’épaisseur de la ligne de précipitation formée). Ces tests sont utilisés communément pour l’analyse des composants d’un sérum de patient. Le sérum est placé dans le puits et les anticorps dirigés contre le sérum sont placés dans la rigole. En comparant les résultats obtenus avec un sérum témoin, il est possible de déterminer s’il existe des déficiences dans un ou plusieurs composants du sérum chez le patient testé ou encore s’il existe une surabondance de certains des composants de ce sérum (par mesure de l’épaisseur de la ligne de précipité formée). Ce test peut aussi être utilisé pour évaluer la pureté de protéines isolées du sérum.
Figure 15	Electrophorèse à contre-courant Dans cet essai, l'antigène et l'anticorps sont placés dans des puits creusés dans un gel d'agarose et l'antigène et l'anticorps sont soumis à une électrophorèse de l’un vers l'autre, au cours de laquelle ils forment une ligne de précipitation comme cela est illustré dans la Figure 15. Ce test ne peut être mis en ouevre que si les conditions permettant à l'antigène et à l'anticorps de migrer en sens opposé sont trouvées (c’est à dire s’ils ont des charges opposées). Ce test est avant tout qualitatif, bien que de l'épaisseur de l’arc de précipitation soit indicatif de la quantité. Son principal avantage réside dans sa rapidité de réalisation.
Figure 16 Figure 17	Tests radioimmunologiques (RIA) ou Immunoenzymatiques (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA) Les essais radioimmunologiques (RIA) sont basés sur la mesure de la radioactivité associée aux complexes immuns. Dans n’importe lequel de ces tests, un marqueur radioactif peut être placé sur l’antigène ou sur l’anticorps. Dans les tests immunoenzymatiques (ELISA), on mesure des réactions enzymatiques associées aux complexes immuns. Dans n’importe lequel de ces tests, l’enzyme peut être attaché sur l’antigène ou sur l’anticorps. Test RIA/ELISA compétitifs pour la détection des antigènes La méthode et le principe des tests RIA et ELISA pour la quantification des antigènes sont illustrés dans la Figure 16. En utilisant des quantités connues d’un antigène standard non-marqué, on peut construire une courbe étalon de la radioactivité (cpm) ou de l’activité enzymatique en fonction de la quantité d’antigène. A partir de cette courbe étalon, on peut déterminer la quantité d’antigène présente dans un échantillon donné. La clé pour la réussite de ces tests est de pouvoir séparer les complexes immuns des composants restants. Cela peut être réalisé de différentes façons qui donnent souvent leur nom au test lui-même. Précipitation au sulfate d’ammonium Le sulfate d’ammonium (concentration finale 33 - 50%) pourra précipiter les immunoglobulines mais pas la plupart des antigènes. Cette méthode peut être utilisée pour séparer les complexes immuns des antigènes libres. Cette méthode a aussi été appelée test de Farr. Anticorps anti-immunoglobuline L’addition d’un anticorps secondaire dirigé contre le premier anticorps ayant réagi avec l’antigène peut conduire à la précipitation des complexes immuns formés et donc leur séparation de l’antigène libre. Immobilisation de l’anticorps L’anticorps peut être immobilisé sur une bille de plastique ou sur une plaque de plastique. Les complexes antigènes/anticorps peuvent alors facilement être séparés des autres composants par simple lavage des billes ou des plaques de plastique (Figure 17). C’est la méthode la plus usitée de nos jours : on l’appelle RIA ou ELISA en phase solide. Dans les laboratoires d’analyse, les tests compétitifs de RIA ou d‘ELISA sont communément utilisés pour quantifier des protéines du sérum, des hormones, des métabolites divers.
TUTORIEL TEST ELIZA HHMI Requires Flash
Figure 18 Figure 19	Tests RIA/ELISA non-compétitifs pour la détection d’antigènes ou d‘anticorps Des tests RIA et ELISA non-compétitifs sont également utilisés pour la quantification des antigènes et des anticorps. Comme montré dans la Figure 18, la bille de plastique peut être recouverte d'antigène et est utilisée pour la détection des anticorps dans un échantillon inconnu. La quantité du second anticorps marqué lié à la bille est proportionnelle à la quantité d'anticorps dans l'échantillon inconnu. Ce dosage est couramment utilisé pour la quantification des anticorps de la classe IgE dirigés contre des allergènes spécifiques en utilisant un allergène connu comme source d'antigène et des anticorps anti-IgE comme réactif marqué. C'est ce qu'on appelle le test RAST (RadioAllergoSorbent Test). Comme indiqué dans la Figure 19, la bille de plastique peut être recouverte d'anticorps et est utilisée pour mesurer un antigène inconnu. La quantité du second anticorps marqué qui se lie est proportionnelle à la quantité d'antigène liée au premier anticorps.
Figure 20	Tests pour les antigènes associés aux cellules Immunofluorescence L’immunofluorescence est une technique dans laquelle un anticorps marqué par une molécule fluorescente (la fluorescéine ou la rhodamine ou bien d’autres molécules fluorescentes encore) est utilisé pour détecter la présence d’un antigène localisé dans ou sur une cellule ou un tissu en mesurant la fluorescence émise par l’anticorps lié. Immunofluorescence directe En immunofluorescence directe, c’est l’anticorps spécifique de l’antigène qui est directement marqué avec le fluorochrome (Figure 20).
Figure 21	Immunofluorescence indirecte Dans l’immunofluorescence indirecte, l’anticorps spécifique de l’antigène n’est pas marqué mais c’est un anticorps secondaire anti-immunoglobuline dirigé contre l’anticorps spécifique de l’antigène qui est marqué avec le fluorochrome (Figure 21). L’immunofluorescence indirecte est plus sensible que l’immunofluorescence directe car il y a amplification du signal de fluorescence.
Figure 22	Cytométrie en flux La cytométrie en flux est communément utilisée dans les laboratoires d’analyse et de recherche pour identifier et énumérer les cellules exprimant des antigènes particuliers. Les cellules en suspension sont marquées avec un ou plusieurs anticorps fluorescents en suivant les modes directs ou indirects comme pour l’immunofluorescence. Les cellules sont alors analysées par un cytomètre en flux. La Figure 22 illustre le principe de la cytométrie en flux. Dans un cytomètre de flux, les cellules sortent une à une d’une gaine d'écoulement et sont éclairées par un faisceau laser. La quantité de lumière laser qui est réfléchie par les cellules alors qu’elles passent devant le laser peut être mesurée, ce qui donne des informations concernant la taille des cellules. En outre, le laser peut exciter le fluorochrome fixé sur les cellules et la lumière fluorescente émise par les cellules peut alors être mesurée par un ou plusieurs détecteurs.
Figure 23	Le type de données qui est obtenu à partir de la cytométrie en flux est représenté dans la Figure 23. Sur un histogramme d’analyse mono-paramétrique, l’intensité de fluorescence (fluorescence verte par exemple) est représentée sur l'axe des x et le nombre de cellules présentant la quantité de fluorescence est reporté sur l'axe des y. Le pourcentage de cellules fluorescentes peut être déterminé par l'intégration de l'aire sous la courbe. Dans un histogramme bi-paramétrique, l'axe x représente un paramètre de fluorescence (par exemple fluorescence rouge) et l'axe des y est le second paramètre (par exemple la fluorescence verte). Le nombre de cellules est indiqué par le contour et l'intensité de la couleur.
Figure 24 PowerPoint animation of figure 24 of this figure	Réaction de fixation du complément Les complexes antigènes/anticorps peuvent également être quantifiés par leur capacité à fixer le complément, car un complexe antigène/anticorps va "consommer" le complément si celui-ci est ajouté à la solution, alors que les antigènes ou des anticorps libres ne peuvent consommer le complément. Les tests de détection des complexes antigènes/anticorps basés sur la consommation du complément sont appelés « réactions de fixation du complément » et sont utilisés pour quantifier indirectement les réactions antigène/anticorps. Ces tests ne fonctionnent qu'avec les anticorps ayant la propriété de fixer le complément (ce sont les IgG et les IgM qui fixent le plus efficacement le complément). Le principe du test de fixation du complément est illustré dans la Figure 24. L’antigène est mélangé dans un tube avec le sérum dans lequel on souhaite doser les anticorps et les complexes antigènes/anticorps peuvent alors se former. Un tube témoin dans lequel aucun antigène n’est ajouté est également préparé. Si aucun complexe antigène/anticorps n’est formé dans le tube, le complément ajouté dans le tube ne pourra être fixé et sera disponible sous forme libre. Par contre, si des complexes antigène/anticorps sont formés, ils pourront fixer le complément et ainsi réduire la quantité de complément libre présente dans le tube. Après avoir laissé le temps aux complexes antigène/anticorps de fixer le complément, une quantité standard de globules rouges, préalablement recouverts d'anticorps anti-érythrocytaires, est ajoutée. La quantité de globules rouges recouverts d’anticorps est prédéterminée pour être juste suffisante pour utiliser tout le complément ajouté initialement dans le tube. Si tout le complément est encore présent (c'est à dire s’il n’y a pas de complexes antigènes/anticorps formés entre l'antigène et l'anticorps en question), tous les globules rouges seront alors lysés. Par contre, si des complexes antigènes/anticorps sont formés entre l'antigène et l'anticorps en question, une partie du complément sera consommée par ces complexes et, par conséquent, lorsque les globules rouges recouverts d’anticorps seront ajoutés, il restera moins de complément disponible pour conduire à la lyse des globules rouges et moins de globules rouges seront lysés. En mesurant tout simplement la quantité de globules rouges lysés (rce qui peut être obtenu en dosant la libération de l'hémoglobine dans le milieu), on peut quantifier indirectement la formation des complexes antigènes/anticorps dans le tube. Les tests de fixation du complément sont le plus couramment utilisés pour le dosage des anticorps dans un échantillon biologique, mais ils peuvent aussi être adaptés pour quantifier l'antigène.
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