DOENÇAS INFECCIOSAS

VIROLOGIA -  CAPÍTULO TRÊS

ESTRATÉGIAS DE REPLICAÇÃO DE VÍRUS DE DNA  

Dr Margaret Hunt
Professor Emerita
Department of Pathology, Microbiology and Immunology
University of South Carolina School of Medicine

Tradução: PhD. Myres Hopkins

 

OBJETIVOS

Análise descritiva das estratégias replicativas empregadas por vírus de DNA animais

Identificação de prototipos virais associados a diferentes esquemas de replicação de vírus de DNA

GENERALIDADES

Genomas virais contém informações que:

• garantem a replicação de genomas virais

• garantem o empacotamento de genomas em virions

• alteram a estrutura e/ou função da célula hospedeira em maior ou menor grau.

ESTRATÉGIA VIRAL

Estratégia viral se refere à maneira pela qual cada vírus realiza as funções acima. Visto que um vírus é um parasita intracelular, ele tem que operar dentro dos limites impostos pela célula hospedeira, ou contornar essas limitações.

ESTRATÉGIA DE REPLICAÇÃO DE VÍRUS DE DNA

Generalidades

• O vírus precisa fazer RNAm que pode ser traduzido em proteínas pela maquinária de tradução da célula hospedeira.

•  O vírus precisa replicar seu genoma.

• Enzimas do hospedeiro para a síntese de RNAm e para a replicação do DNA são nucleares (exceto as que estão nas mitocôndrias) e assim, se um vírus quizer se beneficiar dessas enzimas, ele tem que entrar no núcleo.

FAMÍLIA DOS PARVOVÍRUS

A família do papilomavírus foi inicialmente agrupada junto com a família do poliomavírus na família papovavírus (PApilloma, POlyoma, vírus VAcuolante símio 40) porque membros de ambas as famílias têm uma estrutura similar. Entretanto, agora está claro que as duas famílias têm uma estratégia de replicação muito diferente e porisso cada grupo ganhou o estatus de família.

Papilomavírus (figura 1) são difíceis de crescer em cultura.  Eles não vão ser discutidos posteriormente nesta seção (mas veja a seção de vírus de DNA tumorais).   

Figura 3 Expressão gênica inicial
Nota: - - - - indica regiões do transcrito primário que são removidas no RNAm processado por splicing alternativo. Modificado de Fiers et al.,Nature 273:113

 
Figura 4 Expressão gênica tardia
Nota: - - - - indica regiões do transcrito primário que são removidas no RNAm processado por splicing alternativo. Setas em ponta de lança indicam regiões traduzidas em proteínas
Modificado de Fiers et al.,Nature 273:113

FASE INICIAL DO CICLO LÍTICO

Expressão gênica inicial (figura 3)

O promotor inicial é reconhecido pela RNA polimerase IIdo hospedeiro (SV40 contém um potente  acentuador). Modificação pós-transcricional do RNA (5’ Cap, metilação, poliadenilação, splicing,  etc.) é realizado por enzimas do hospedeiro. O transcrito inicial (transcrito primário) é feito e este sofre processamento alternativo, resultando em RNAm para os antígenos T pequenos e grandes (essas proteínas têm mesmo terminal amínico, mas terminais carboxílicos diferentes).

Os RNAm são traduzidos no citoplasma.

Nota: Transcritos primários que podem ser processados e codificam para mais de uma proteína são encontrados em algumas famílias de vírus e na célula hospedeira.

 

FASE TARDIA DO CICLO LÍTICO

Por definição a fase tardia se inicia com a replicação do genoma viral.

Replicação do DNA

A replicação do DNA do SV40/polyoma ocorre no núcleo. 

Grande antígeno T é necessário para a replicação do DNA. Ele se liga à origem de replicação.

Vírus do polioma usam a DNA polimerase da célula hospedeira, que reconhece a origem de replicação viral ‘se’ o antígeno T estiver presente.

A replicação do DNA é bidirecional (Há duas forquilhas de replicação por DNA genômico circular e a replicação envolve fitas  de replicação sentido/anti-sentido, fragmentos de Okazaki, DNA ligase, etc.). Este processo de replicação do DNA é muito semelhante ao que acontece na célula hospedeira – o que não é de surpreender, pois o vírus está usando principalmente a maquinária hospedeira, exceto pelo envolvimento do antígeno T.

Complexo de histonas hospedeiras, com DNA recém sintetizado.

 

Expressão gênica tardia (figura 4)

RNAm tardios são feitos após a replicação do DNA (uma grande quantidade de DNA viral recém-sintetizado está agora disponível como molde). RNAm iniciais ainda estão sendo transcritos, mas em velocidade muito menor.

O antígeno T está envolvido no controle do aumento da transcrição do promotor tardio e da diminuição da transcrição do promotor inicial. Ele também interage com proteínas hospedeiras e muda as propriedades da célula hospedeira, agindo assim na transformação celular e formação de tumor.

VP1, 2, e 3 são feitas do mesmo transcrito primário, que realiza splicing diferencial (figura 5). Isso faz com que o início da leitura de VP1 seja diferente do de VP2 e VP3. Dessa forma, uma região do DNA pode codificar para duas sequências de aminoácidos diferentes, dependendo do códon de iniciação utilizado. Esta é uma outra maneira pela qual vírus (e células) podem usar um trecho pequeno de DNA para codificar para mais de uma sequência protêica.

MONTAGEM

Os RNAm de VP1, 2 e 3 são traduzidos no citoplasma, as proteínas são transportadas para o núcleo, e os capsídios são montados com DNA (e histonas da célula) dentro do capsídeo. Grandes quantidades de capsídeos se acumulam no núcleo e formam corpos de inclusão. Virions são liberados por lise celular.

 

Figura 7b
Estrutura do adenovirus

ADENOVÍRUS

CÍCLO LÍTICO

Adsorção e penetração

Adenovirus normalmente infectam células epiteliais. As fibras se ligam a receptor na superfície das células e o vírus é englobado por endocitose. O vírus aparenta ser capaz de lisar endossomas. O desnudamento ocorre em etapas. O DNA é liberado no núcleo (provavelmente em um poro nuclear) (figura 9).

Fase inicial

Transcrição inicial: O adenovírus usa a RNA polimerase da célula hospedeira e RNAm iniciais são transcritos a partir de regiões dispersas em ambas as fitas (figura 10). Múltiplos promotores permitem maior flexibilidade de controle. RNAm são processados pela célula hospedeira, 5’ Cap, metilação, poliadenilação e (às vezes) sistemas enzimáticos de splicing, sendo então exportados para o citoplasma e traduzidos.

 

A  
B Figura 8 Modêlos do virion do adenovirus. A: Uma reconstrução de imagem tridimensional da partícula intacta do adenovírus vista em conjunto com um icosaedro tri-axial (© EMBL Virus Structure Resource). B: Uma seção estilizada da partícula do adenovírus baseada na compreensão atual dos seus componentes polipeptídicos e DNA. Nenhuma seção real do icosaedro conteria todos os componentes. Os constituintes virais são designados por seus números de polipeptídeo com exceção da proteína terminal (TP). Adaptado de Fields et al., Fundamental Virology (1996).
 

As proteínas iniciais incluem as que:

• são necessárias para a transcrição (proteína E1A é necessária para a transcrição dos outros genes iniciais; como resultado disso esses outros genes são às vezes referidos como genes "tardios iniciais" e E1A é referido como um gene "inicial imediato"). 
• são necessárias para a síntese de DNA do adenovírus (inclui DNA polimerase)
• alteram a expressão dos genes da célula hospedeira. Isso inclui genes cujos produtos interferem na resposta antiviral do hospedeiro e/ou interfere na regulação do ciclo celular

 Figura 9  Representação diagramática da captação e desnudamento de partículas de adenovírus. Adaptado de Zinsser Microbiology 20^th Ed. 
Figura 10
Mapa de transcrição do adenovírus. Genes inicias são mostrados em vermelho. Verde indica genes tardios. Linhas azuis indicam DNA. Colchetes indicam a posição de promotores. Transcritos primários são feitos a partir de cada promotor e em seguida sofrem splicing alternativo, o diagrama acima não mostra o transcrito primário. Mostra apenas aquelas regiões presentes nos produtos do splicing alternativo. Regiões ausentes indicam íntrons removidos.

Adaptado de Broker, T.R. In Processing of RNA. (Apirion, D ed) 181-212, 1984
 

 

Fase tardia

Replicação do DNA:

O adenovírus codifica para sua própria DNA polimerase (que é uma das proteínas iniciais). O DNA é replicado por um mecanismo de deslocamento de fita (figura 11). Não há fragmentos de Okazaki, ambas as fitas são sintetizadas de forma contínua.

DNA polimerases não podem iniciar síntese de novo, elas precisam de um primer. No caso do adenovírus, a proteína (TP) codificada pelo vírus age como um primer. Ela está ligada covalentemente à ponta 5’ de todas as fitas de DNA de todos os adenovírus.

 

 Figura 13 Processamento do transcrito primário viral

Transcrição tardia:

A maneira pela qual a transcrição tardia é ligada ainda não é bem compreendida. RNAm tardios codificam predominantemente para proteínas estruturais e existe UM promotor tardio principal (figura 12). O transcrito primário é processado para gerar vários RNAm monocistrônicos (figura 12 e 13):

Há dois tipos de clivagem do transcrito primário:

i. para produzir vários terminais 3' que são depois poliadenilados

ii. para a remoção de introns 

Não é compreendido como este processo é controlado para que as quantidades corretas de cada RNAm sejam feitas. Ao que parece o vírus faz mais RNAm e proteínas do que as necessárias para a montagem do vírion, de forma que o controle preciso não é necessário.

Montagem

A montagem das partículas do adenovírus ocorre no núcleo. O DNA entra nas partículas após capsídeos imatudos forem formados. Os capsídeos sofrem processo de maturação, após o que as células lisam e os vírios escapam.

Mais proteínas estruturais do que necessárias são feitas, e o excesso de proteínas estruturais acumula no núcleo, onde formam corpos de inclusão.

 Figura 14a 
Estrutura do vírus do herpes

Figura 14b
Virus do herpes simplex  © Dra. Linda M Stannard, Universidade de Cape Town, África do Sul, 1995 (usado com permissão). 

VÍRUS DO HERPES  

Figura 15b
Fusão do vírus ligado à membrana com a membrana plasmática

Adsorção e penetração

Muitos vírus do herpes, incluindo o vírus do herpes simplex, pode se fusionar diretamente com a membrana plasmática (levando ao desnudamento parcial) (figura 15). Esta fusão com a membrana plasmática tem implicações tanto para o vírus como para a célula hospedeira. Entre estas se incluem:

i) Visto que a proteína de fusão está ativa em pH fisiológico, se ela estiver inserida na membrana celular hospedeira durante o ciclo de crescimento do vírus, a célula infectada pode potencialmente se fusionar com outras células e formar um sincício.

ii) A membrana viral deixa suas "impressões digitais" na membrana plasmática e esta é uma possível dica de que a célula está infectada (figura 15b)

Os capsídeos são transportados para o núcleo e o DNA passa para o núcleo (provavelmente via poros nucleares)

 

Fase inicial

Transcrição inicial (os RNAm durante esta fase são os RNAm alfa e beta) (figura 16)

O vírus do herpes usa RNA polimerase hospedeira. Entretanto, um proteína de tegumento do vírion (VP16) entra no núcleo com a infecção e é importante como parte do complexo fator de transcrição reconhecido pela RNA polimerase. O vírus usa enzimas de modificação do RNA hospedeiras.

Inicialmente, RNAm alfa são transcritos. Estes são RNAm imediatamente iniciais e são exportados para o citoplasma e traduzidos em proteínas alfa. As proteínas α traduzidas no citoplasma são transportadas para o núvleo, onde elas habilitam os promotores beta para serem usados pela RNA polimerase hospedeira (figura 16).

RNAm beta são transcritos pela RNA polimerase hospedeira. (Genes beta são ainda “iniciais” visto que eles são transcritos antes da síntese do DNA. Às vezes entretanto, genes alfa são chamados de “imediatamente iniciais” e genes beta são chamados “iniciais”). Proteínas beta estão envolvidas na regulação da expressão gênica. Eles diminuem a expressão do gene alfa e são necessários para a expressão do gene gama. Eles estão também envolvidos em vários aspectos da síntese do DNA; por exemplo, genes beta do herpes codificam para uma variedade de proteínas incluindo:

• DNA polimerase

• Proteínas de ligação a DNA

• Timidina cinase

•  Ribonucleotídeo-redutase

TENDO EM VISTA QUE ESSAS PROTEÍNAS BETA SÃO CODIFICADAS PELO VÍRUS E NÃO SÃO ENZIMAS CODIFICADAS PELO HOSPEDEIRO, ELAS SÃO POTENCIALMENTE “PONTOS DE VULNERABILIDADE” NO CICLO DE VIDA DO VÍRUS, SENDO PORTANTO ALVOS PROMISSORES PARA QUIMIOTERAPIA ANTIVIRAL

Figura 18 Possíveis estruturas genômicas do vírus do herpes

Fase tardia

Replicação do DNA

O vírus do herpes codifica para várias proteínas, além da DNA polimerase, que são necessárias para a replicação do DNA. O mecanismo preciso da replicação do DNA não é conhecido. A replicação do DNA é acompanhada de inúmeras recombinações. O DNA replicado está presente contanto que moléculas concataméricas (repetições em tandem do genoma ligado “cabeça à cauda”). Estas são clivadas até o tamanho do genoma quando o DNA é empacotado no vírion (figure 18). 

Alguns vírus herpes (ex. Vírus do herpes simplex) têm uma estrutura genômica na qual duas partes do genoma podem inverter uma em relação à outra (figura 18), e outros não. A importância disso não está clara.

Transcrição tardia

Por definição, transcrição tardia ocorre após a replicação do DNA. RNAm gama são produzidos e são trasuzidos no citoplasma. Proteínas gama são predominantemente estruturais. Há uma expressão diminuída de genes beta no estágio tardio. Isso se deve provavelmente à regulação negativa da transcrição dos genes beta por uma das proteínas gama.

No vírus do herpes não há aparente organização do genoma em blocos de transcrição inicial ou tardia.

Figura 19B
Vírus do herpes simplex sobre e dentro de um linfócito de sangue periférico  © Dennis Kunkel Microscopy, Inc.  Usado com permissão  
 

Montagem

A montagem ocorre no núvleo. Um capsídeo é formado e o DNA entra no capsídeo. Os capsídeos adquirem um envelope ao brotar através de áreas da membrana nuclear interna que tenham proteínas de membrana virais nelas inseridas (figura 19). Essas áreas têm proteínas tegumentares associadas com a face interna da membrana nuclear interna. O envelope viral se fusiona então com a membrana externa e o nucleocapsídeo desenvelopado é liberado no citoplasma, onde adquire um tegumento mais maduro. Eles se tornam então re-envelopados pelo brotamento em vesículas derivadas das vesículas de Golgi e são então liberados.

A proteína tardia requerida para a transcrição de RNAm imediatamente iniciais na próxima rodada de infecção é empacotada no vírion.

O excesso de proteínas estruturais se acumula no núcleo, frequentemente formando corpos de inclusão (parte do efeito citopático).

ASPECTOS DIGNOS DE NOTA SOBRE O VÍRUS DO HERPES

Não há blocos definidos de genes iniciais ou tardios

Eles são mais independentes do que alguns dos vírus menores

Devido ao fato de serem mais independentes, eles têm mais “pontos de vulnerabilidade” que podem ser alvos de drogas

   Figura 19C    Estágios na exocitose do vírus do herpes do núcleo, em que o core do vírus é montado, para a membrana plasmática

VÍRUS DE DNA CITOPLASMÁTICOS  

Há várias razões pelas quais poxvirus (figura 20) têm importância:

• Certos poxvírus são um fato histórico, tal como o vírus da varíola (figura 21) e vaccinia (varíola bovina, que foi usado na vacina da varíola (veja aqui)

• Vírus pox podem ser possíveis agentes de bioterrorismo

• Vírus pox são usados em novas técnicas de desenvolvimento de vacinas (tal como a vaccinia produzida por engenharia genética)

Poxvirus replicam no citoplasma. Isso significa que eles devem ter sua própria maquinária de síntese de RNA e DNA.

Vaccinia é o mais intensivamente estudado membro da família dos poxvirus.

Adsorção e penetração

O vírus se liga a receptores da superfície celula. Ele entra nas células via endocitose ou via fusão direta do vírus com a membrana plasmática. O vírus é então liberado no citoplasma, sem sua membrana.

 

Fase inicial

Transcrição inicial

Após a fase inicial do desnudamento ter ocorrido, o vírus pode fazer um número limitado de RNAm (os RNAm imediados iniciais). Para fazer isso, o poxvírus precisa de uma RNA polimerase dependente de DNA. A RNA polimerase hospedeira está no núcleo celular e isso explica porque os poxviruses usam uma RNA polimerase dependente de DNA codificada pelo vírus para fazer seus RNAs. Visto que esta enzima é necessária imediatamente à infecção, ela deve ser trazida para a célula infectada com o DNA da vaccinia, e assim se apresenta nos virions. DNA “nu” da vaccinia que teve todas as proteínas removidas é portanto não infeccioso, visto que ele não tem RNA polimerase associada a ele, e nada acontece no ciclo de vida do vaccinia sem a RNA polimerase do vaccinia, uma vez que nenhum RNA ou proteínas podem ser produzidos.

RNAm do poxvirus têm a 5’ Cap, são metilados e poliadenilados tais como os RNAm eucarióticos, mas os RNAm da célula hospedeira são modificados no núcleo e o vaccinia replica no citoplasma. Uma vez sendo o vaccinia citoplasmático, essas modificações devem ocorrer por enzimas codificadas pelo vírus. As enzimas modificadoras são empacotadas em vírions e assim aqueles RNAm feitos imediatamente após a infecção podem ser modificados. Até o presente nenhum RNAm feito por splicing foi demonstrado para o vaccinia (isso não é de surpreender, visto que ele replica no citoplasma e enzimas hospedeiras de splicing estão no núcleo).

Um dos produtos de tradução de RNAm iniciais é uma enzima de desnudamento. Ela permite desnudamento posterior do DNA do vaccinia e mais genes podem agora ser transcritos – os genes inicias são todos expressos agora. Poxvírus são excepcionais por codificarem para uma proteína de desnudamento que tem que ser feita na célula recém-infectada, antes do desnudamento ser concluído.

“Fábricas” de produção viral são encontradas no citoplasma – sítios de replicação do vírus vaccinia.

As proteínas iniciais estão envolvidas na replicação do DNA, transcrição do RNA, modificação do RNA e desnudamento. Elas também incluem algumas proteínas estruturais.

Fase tardia

Síntese de DNA

A síntese de DNA ocorre em "fábricas" e usa um mecanismo não usual que não será tratado aqui.

Transcrição e tradução tardias

Este é um processo complexo. Algumas proteínas tardias são feitas durante a fase tardia, mas outras somente no começo da fase tardia. Algumas proteínas iniciais não são sintetizadas quando a replicação do DNA começa, enquanto que outras proteínas iniciais são feitas durante a fase tardia, assim como as de fase inicial. Assim há um controle complexo de quais proteínas são feitas pelo vaccinia e quando elas são feitas. Isso significa que existem outros contrôles além dos simples controles inicial/tardio (Este é um vírus muito grande, daí a complexidade é de se esperar).

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