INFECTIOUS DISEASE

BAKTERİYOLOJİ – BÖLÜM İKİ
ENFEKSİYON ETKENLERİNİN TANIMLANMASI VE ÜRETİLMESİ

Dr Alvin Fox
Emekli Profesör
South Carolina Üniversitesi Tıp Fakültesi

Çeviren.
Prof. Dr. Mustafa Demirci
İzmir Katip Çelebi Üniversitesi,
Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji A.D. İzmir, Türkiye
 

Let us know what you think
FEEDBACK

ANAHTAR KELİMELER İzolasyon (kültür); Agar pleyt / koloniler, Sıvı besiyeri – test tüpü – yığın, Tanımlama ve taksonomi; aile, cins, tür, tip, Biyokimyasal (fizyolojik) testler, moleküler testler; DNA-DNA homolojisi, 16S rRNA dizilemesi, Kimyasal profil, Kültür dışı tabanlı tanımlama; Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), Aglutinasyon (antijen saptama), boyama, Seroloji (antikor tespiti)

Farklı bakterilerin neden olduğu klinik görünüş ve sonuçlarında çeşitlilik olan enfeksiyon hastalarının tedavisine yardımcı olmak için hastalardan bakterilerin izole edilmesi ve tanımlanması önemlidir. İzole edilen bakterilerin antibiyotik duyarlılık testleri (örneğin; minimum inhibitör konsantrasyonunun:MIC gösterilmesi) enfeksiyon hastalığının antibiyotik seçimine yardımcı olabilir. Aynı zamanda, bazı türler veya kökenlerin (suş) atipik olarak normalden fazla izole edilmesi bizlere, örneğin hastanede, kontamine hastane malzemeleri veya bazı hastane personelinin kötü aseptik koşullara sahip olması nedeniyle bir salgın oluştuğunu gösterebilir.

Hastalarda bir bakteriyel enfeksiyondan kuşkulanıldığı zaman, olağan olan, bu hastalardan alınan saf kültürde (agar pleytleri üzerine) etken mikroorganizmanın görünür kolonilerinin izole edilmesi ve sonra da organizmanın spesifik özelliklerinin gösterilmesidir. Klinik mikrobiyolojik örneklere uygulanan tanımlama, taksonomik ilkelere dayanmaktadır. Tanı laboratuvarında, birçok örnek her gün ve mümkün olduğunca hızlı bir şekilde tanımlanmalıdır. Testler kolayca öğrenilebilen, düşük maliyetle ve hızlı sonuçlananlardan seçilmelidir. Bakterilerin spesifik özelliklerini gösteren klasik yöntemler, bakterilerin morfolojik ve metabolik özelliklerine dayanmaktadır. Tanı testleri deneysel olarak ayırıcı bilgi sağlama temelinde seçilmişlerdir. Birçok hedef patojenin her biri için farklı testler tanımlanmıştır. Buna ek olarak, spesifik genlerin ya da gen segmentlerinin tanımlanması için, moleküler biyoloji teknikleri artık laboratuvarlarda yaygın olarak kullanılmaktadır.

Modern taksonomik yaklaşımlar, genellikle teknik olarak daha karmaşık bir yöntem içerirler ve bakterilerin yapısal bileşiminin profilini ortaya koymayla ilgilidirler. Bu yöntemler genellikle "moleküler biyoloji" ya da "analitik kimya" tabanlı yaklaşımlar içermektedir. Artık, bilinmektedir ki bakterilerin farklılığını gösteren klasik şemaların birçoğu, genetik farklılık veya yakınlık için çok az bilgi verir ve bazı durumlarda bilimsel yanlışlıklara sahiptir. Yeni yaklaşımlarla elde edilen bilgiler sonucu, klasik yöntemlerle tanımlanan belirli bakteri türlerinin yeniden adlandırması yapılırken, bazı durumlarda bakteri ailesi içinde ve aralarındaki taksonomik ilişkilerin tamamen yeniden düzenlenmesi bir ihtiyacı oluşmuştur.
 

Şekil 1. Bacillus anthracis'in bikarbonat ve kanlı agar kültürleri. Bikarbonatlı besiyerinde pürüzsüz koloniler (solda) ve kanlı agarda kaba (pürüzlü) koloniler (sağda). CDC / Dr. James Feeley

Şekil 2. Gram boyama prosedürü.

Aile: benzeri cinslerin bir grubunu temsil eder.

Cins: benzeri türlerin bir grubunu temsil eder.

Tür: benzeri suşların bir grubunu temsil eder.

Tip: Bir türün içindeki belirli özellikleri aynı olan suş setleri (örneğin; biyotipler, serotipler).

Suş (köken): bir spesifik özelliği olan türdeki bir izolat ve bunun bir dizisi.

En sık kullanılan terim tür adıdır. (örneğin, Streptococcus pyogenes, -kısaltması; S. pyogenes). Tür adı yazılırken iki bölümü her zaman vardır. Birinci bölüm cins adını tanımlar "örnekte, Streptococcus", ikinci bölüm ise tür adını tanımlar "örnekte, pyogenes". Cins isim her zaman büyük harfle başlar ama tür adı küçük harfle yazılabilirken, hem cins hem de tür adı italik veya altı çizili yazılmalıdır.

Bakterilerin tanı amaçlı izolasyonu ve tanımlanmasında adımlar

1. Basamak. Vücut sıvılarının numuneleri (örneğin, kan, idrar, beyin omurilik sıvısı) kültür pleytleri üzerine çizgi şeklinde ekilmektedir ve birkaç gün kuluçkadan sonra, bakterilerin izole kolonileri (çıplak gözle görülebilen) görünür (Şekil 1). Her koloni milyonlarca bakteri hücresinden oluşur. Bu kolonilerin boyutunun, dokusunun, renginin ve (kanlı agar üzerinde büyümüş ise) hemoliz reaksiyonlarının gözlenmesi bakteri tanımlamasının ilk adımı için oldukça önemlidir. Organizmanın büyüme için oksijen gereksiniminin olup olmaması başka önemli ayırt ettirici özelliğidir.

2. Basamak. Koloniler ve Gram boyalı bireysel bakteri hücreleri mikroskop altında incelenir.

3. Basamak. Bakteri bu izole koloniler kullanılarak tür düzeyinde tanımlanır. Bu genellikle ilave bir 24 saatlik büyüme süresi gerektirir.
 

Şekil 3. Gram Boyama Örnekleri

  Bacillus brevis. Gram boyama. CDC / Dr. William A. Clark

  Streptococcus mutans. Gram boyama. Kanlı agar pleyti, kültürü zincirleri olmadan kok-gibi morfoloji verir. Organizma subakut bakteriyel endokardit ve diş çürümelerine neden olabilir. CDC / Dr. R, Facklam

  Bacillus anthracis. Gram boyama. CDC / Dr. James Feeley

  Streptococcus mutans. Gram boyama. Tiyoglikolat sıvı kültür. Sıvı besiyerinde üretildiği zaman morfoloji çubuk benzeri zincirleri ile. Subakut bakteriyel endokardit ve diş çürümelerine neden olabilir. CDC / Dr. Richard Facklam

Gram boyama

Bir koloniden alınan bakteri süspansiyonu bir slayt üzerinde kurutulur ve (Şekil 2 ve 3), aşağıdaki gibi boyanır:

1. Adım. Kristal viyole ile boyama.

2. Adım. Kristal viyole boyasının sabitleyici iyot ile tespit edilmesi. Tüm bakteriler mor ya da mavi kalır.

3. Adım. Alkol ya da başka bir çözücü ile boyanın uzaklaştırılması. Bazı bakteri boyayı kaybeder (Gram negatif) ve diğerleri kaybetmez (Gram pozitif).

4. Adım. Safranin ile zıt boyama. Gram pozitif bakterilerin kristal viyole boyasını vermediği için mor kalır. Gram negatif bakteriler pembe boyanır.

Mikroskop altında, bakteri dış görüntüsü görüldüğünde, sorulması gereken sorular şunlardır:

• Gram pozitif veya negatifler mi?
• Morfoloji nedir (çubuk, kok, spiral, pleomorfik [değişken form] vb)?
• Bakteriler tek başına, çiftler ya da zincir v.b. şeklinde mi?
• Bakterilerin büyüklüğü nasıl?

Gram boyama yanı sıra, diğer daha az yaygın kullanılan boyalar (örneğin; sporlar ve kapsüller için) vardır. Primer kültür pleytinde üreyen benzer kolonilerin daha sonra biyokimyasal özellikleri incelenir; Örneğin, bu bakteriler laktoz gibi bir şekeri fermente eder mi? Bazı durumlarda, bakteri yüzey antijenlerini tanıyan ticari olarak temin edilebilen antikorlarla tanımlama (örneğin; agregasyonu: kümelenme ile) yapılabilir. Diğer ticari moleküler testler artık yaygın olarak kullanılmaktadır.

Bakterilerin taksonomik tanımlaması

Bir tür içinde bile önemli çeşitlilik bulunmaktadır. Bundan dolayı türlerin karşılaştırılmaları için her türden çok sayıda suşları karşılaştırılmaları gerekir. Karşılaştırmalar esas olarak kimyasal veya moleküler analizlere dayanmaktadır.

Kimyasal analiz

Bakterilerin yapısal bileşenlerini (en yaygın; yağ asitleri, karbonhidrat ya da ubikinon profili) incelemek için gelişmiş araçlar kullanılabilir. Salgılanan metabolik ürünlerin (örneğin, uçucu alkoller ve kısa zincirli yağ asitleri) tanımlanması da yararlıdır.

Moleküler analizler

Bakterilerin tüm kromozomal DNA dizilerini karşılaştırmak tanımlama için ideal olabilirdi, ama bu şu anda mümkün değildir. Her bir suş için milyonlarca nükleotid dizisinin gösterilmesi gerekir. Son birkaç yıl içinde, bir kaç bakteri türünün birer temsilcisinin tüm genomlarının (örneğin; bir suş) nükleotid dizisinin sıralaması elde edilmiştir. Her olguda, bu dizileme görevlerine adanan büyük araştırma grubu tarafından yapılan büyük miktarda çalışma yer almıştır. Bunun tarihsel olarak alternatifi genomik benzerlik guanin (G) artı sitozin (C) içeriği tarafından değerlendirilmiştir ve genellikle yüzde (% GC) olarak ifade edilmiştir. Bu yöntem günümüzde hibridizasyon ve sekanslama (gen dizisinin gösterilmesi, en sık 16S rRNA gen kodlanması) gibi iki alternatifle yer değiştirmiştir.

DNA-DNA homolojisi (benzeşikliği) (ya da iki farklı bakterinin DNA iplikleri birbirine kadar iyi bağlanır [hibridize; melezleme]) bakteri suşlarının/ türlerinin genetik akrabalıklarını karşılaştırmak için kullanılır. İki bakteri suşu DNA'sı (örneğin, iyi bağlanırsa) yüksek bir homoloji derecesi gösterirse, suşlar aynı türün bir üyesi olarak kabul edilir. Farklı bakteri türlerinin DNA'ları (yakın ilişki olmadığı sürece) homoloji göstermez.

Son birkaç yıl içinde, 16S ribozomal RNA moleküllerinin (16S rRNA) genetik dizi sıralanması bakteriyel taksonomisinde "altın standart" haline gelmiştir. Bu molekül büyüklüğü yaklaşık altı yüz nükleotittir. 16S rRNA gen dizisi, tüm bakteri dünyası içinde türler seviyesinden genomik benzerlik ilişkisinin mukayesesini sağlayan bir ölçü oluşturmaktadır. Yakından ilişkili bakteri türlerinde genellikle aynı rRNA dizileri vardır. Bu teknik DNA-DNA hibridleşmesi için tamamlayıcı bilgiler sağlar. 16S rRNA genlerinin dizisinin ve diğer genetik bölgelerin dizisinin belirlenmesi, günümüzde “Klinik Mikrobiyoloji” laboratuvarında tanımlamada kullanılmaktadır.

Kültür öncesi hızlı tanı yöntemleri

Bazı kesin insan patojenleri (Tüberküloz, Lyme hastalığı ve frengi etkenleri de dahil) ya laboratuvarda izole edilemez ya da çok zayıf büyüyebilir. Başarılı izolasyon yavaş olabilir veya bazı durumlarda imkansızdır. Bakterinin doğrudan kültür yapılmadan tespiti bazı durumlarda mümkündür.

Hızlı tanı için basit bir test (Antijen tespitine bir örnek olarak) A grubu streptokok için birçok doktor ofislerinde kullanılmaktadır. Hastanın boğazından sürüntü alınır ve streptokok antijen (önceden bakteriyolojik kültür olmadan) çubukta doğrudan çıkarılmış olur. Bakteriyel antijen, antikor kaplı lateks boncukların kümelenmesi (aglütinasyon) ile tespit edilir.
Bakteriyel DNA dizileri, insan vücut sıvılarından (polimeraz zincir reaksiyonu, PCR) doğrudan amplifiye edilebilir. Bu şekilde, belirli bir gen ya da gen kısımları büyük miktarlarda çoğaltılabilir ve kolayca tespit edilebilir. Örneğin, tüberküloz hızlı tanısında büyük başarı elde edilmiştir.

Sonuç olarak, belirli klinik örneklerin direkt mikroskobik incelenmesi (Örneğin, balgamda M. tuberculosis tespiti) bakterilerin varlığının gösterilmesi için yardımcı olabilir.

Bir enfeksiyon meydana geldikten sonra enfekte ajana karşı gelişen antikor cevabının serolojik tanısı (hastanın serumunda) sadece birkaç hafta içinde başarılı olabilir.
 

ANIMATION 
Learn more about PCR 
Biology Animation Library 
Requires Flash

TUTORIAL 
Bacterial ID laboratory
HHMI
Requires Flash

Return to the Bacteriology Section of Microbiology and Immunology On-line

This page last changed on Friday, February 26, 2016
Page maintained by Richard Hunt