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VIROLOGIE - CHAPITRE DEUX


VIROLOGIE FONDAMENTALE: CYCLE DE REPLICATION VIRALE

Dr Margaret Hunt
University of South Carolina School of Medicine
Columbia SC 
USA

Dr Dorian McIlroy
Université de Nantes
France

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PRINCIPAUX EVENEMENTS impliquées dans la réplication

La réplication virale implique les étapes suivantes:

  • Attachement

  • Entrée

  • Décapsidation

  • Expression des gènes viraux

  • Réplication du génome viral

  • Assemblage et maturation

  • Libération
     

Attachement

Le premier problème pour n'importe quel virus est de se fixer spécifiquement à la surface d'une cellule hôte qui est permissive – c'est à dire une cellule qui permettra la réalisation de toutes les étapes subséquentes du cycle de réplication virale. Par exemple, pour un Norovirus – qui provoque des gastroentérites virales - à l'intérieur de votre intestin, il est essentiel de se fixer à la surface d'un entérocyte de la muqueuse de l'intestin, et non pas à la surface d'une des millions de bactéries de la flore intestinale, car les cellules bactériennes ne sont pas permissives pour l'infection par des virus humains.
La fixation d'un virus sur la cellule hôte est effectuée par une interaction spécifique entre une protéine d'attachement virale, et un récepteur cellulaire. Le récepteur est souvent protéique, mais des structures en carbohydrate, ou des glycolipides peuvent également servir de récepteurs aux virus. Les cellules qui n'expriment pas le récepteur ne permettent pas l'attachement des virus, et ne sont donc pas susceptibles à l'infection virale. La présence du récepteur est un facteur important dans le tropisme viral – c'est à dire, quelles cellules de l'hôte seront infectées par le virus. Par exemple, le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) utilise la protéine membranaire CD4 comme récepteur, ce qui explique pourquoi le VIH infecte les lymphocytes T CD4+ et pas des lymphocytes T CD8+.
 

Entrée

Le mécanisme par lequel le virus entre dans la cellule dépend de la structure de la particule virale.

Virus Enveloppés
L’entrée de tous les virus enveloppés implique la fusion de l’enveloppe virale avec l’une des membranes de la cellule hôte, afin de livrer le contenu de la particule virale dans le cytoplasme. La fusion membranaire peut avoir lieu :

A) Directement à la membrane plasmique (Figure 1), suite à l’attachement du virus à son récepteur. C’est le cas du VIH, par exemple.

B) Après l’internalisation de la particule virale par endocytose (Figure 2).

Chez de nombreux virus, une réorganisation structurale importante des glycoprotéines de l’enveloppe est nécessaire afin de permettre la fusion membranaire. L’enveloppe de ce type de virus ne peut pas fusionner directement avec la membrane plasmique. Dans un premier temps, la particule virale est donc internalisée dans des endosomes, puis la maturation de l’endosome active les domaines de fusion des glycoprotéines virales, soit par la baisse du pH à l’intérieur de l’endosome mature, soit par l’action des protéases endosomiales, qui clivent les glycoprotéines virales et déclenchent leur activité de fusion latente. Suivant la fusion de l’enveloppe virale avec la membrane de l’endosome, le contenu de la particule virale est libérée dans le cytoplasme.

Virus Nus

La capside de certains virus nus est capable de se réorganiser après la fixation sur son récepteur, et de former un pore protéique qui traverse la membrane cellulaire. Le génome du virus passe ensuite dans le cytoplasme cellulaire. Ce processus peut avoir lieu directement à la membrane plasmique, ou peut se déclencher seulement après l’endocytose de la particule virale.
Chez d’autres virus nus, la capside entière traverse la membrane cellulaire. Le plus souvent, cela se passe après l’internalisation des particules virales dans des endosomes. Ensuite, les protéines de capside déstabilisent, oui même détruisent la membrane endosomiale, permettant ainsi le passage de la capside vers le cytoplasme.
 

Décapsidation

L’acide nucléique du génome viral doit maintenant être libéré de la capside afin de permettre l’expression des gènes viraux et la réplication du génome viral. Lors de la décapsidation, le génome et la capside virale sont physiquement séparés, et puisque ces deux éléments doivent être réunis pour former une particule virale infectieuse, la décapsidation définit le début de la phase d’éclipse, pendant laquelle il est impossible de détecter des particules virales infectieuses à l’intérieur de la cellule hôte.
Pour de nombreux virus (par exemple, les Picornaviridae), la décapsidation coïncide avec l’étape d’entrée, tandis que pour d’autres il s’agit d’une étape bien distincte. En particulier, pour tous les virus à ADN qui se répliquent dans le noyau (par exemple, les Adenoviridae et les Herpesviridae), la décapsidation a lieu seulement à l’arrivée des capsides virales aux pores nucléaires, bien après l’entrée du virus dans la cellule.
 

Expression des gènes viraux / Réplication du génome viral

Les stratégies utilisées pour l’expression et la réplication des génomes viraux varient en fonction de la classe de Baltimore du virus. Certaines d’entre elles seront présentées aux chapitres ultérieurs.
 

Assemblage et maturation

L’expression des gènes viraux permet la synthèse des protéines virales, et la réplication permet l’accumulation de multiples copies du génome viral. L’association des protéines de structure virales avec l’acide nucléique viral aboutit à l’assemblage de nouvelles particules virales. La phase d’éclipse se termine donc avec l’étape d’assemblage. Il arrive souvent que les particules virales formées initialement soient immatures – c’est-à-dire, peu infectieuses ou instables. Une étape de maturation est alors nécessaire afin de produire des particules virales infectieuses.
 

Libération

Les particules virales peuvent être libérées par la lyse cellulaire, ou dans les cas des virus enveloppés, par bourgeonnement. Le processus de bourgeonnement n’est pas forcément fatal pour la cellule hôte. Il est donc possible pour certains virus enveloppés de maintenir une infection productive de façon persistante.
Toutes les particules virales libérées d’une cellule infectée ne sont pas forcément infectieuses. En effet, le rapport de particules non-infectieuses aux particules infectieuses varie selon le virus.
 

 

Protéines structurales et non-structurales

Toutes les protéines virales incorporées dans la particule virale sont considérées comme des protéines de structures – même si elles ne contribuent pas à la morphologie ou la stabilité de la particule. Les protéines non-structurales sont celles qui sont exprimées dans la cellule infectée, mais qui ne sont pas incorporées dans la particule virale.
 

Figure 1
Fusion d’un virus avec la membrane plasmique après attachement sur un récepteur cellulaire.

 

 

Figure 2 Fusion d’un virus avec la membrane endosomiale.

hiv_bud.jpg (41452 bytes) Figure 3 Visualisation des particules du VIH-1 en cours, et après leur relargage par bourgeonnement. Microscopie électronique à transmission.   CDC

 

Figure 4.  Bourgeonnement du VIH-1 à la surface d’un lymphocyte infecté. Microscopie électronique à transmission, au grossissement de 133 335x © Dennis Kunkel Microscopy, Inc.  Used with permission

plaque.jpg (141065 bytes)  Figure 5
Plages de lyse. Des dilutions en cascade d’un échantillon de virus ont été étalées sur des cellules en monocouche. Plusieurs jours d’incubation permettent une particule virale d’infecter une cellule et de la tuer. Les virus libérés par la première cellule infectée se fixent sur les cellules voisines, qui sont tuées à leur tour. La coloration permet de visualiser les zones blanches où les cellules ont été tuées par l’infection virale. Chaque "plage" de lyse résulte de la présence, à l’origine, d’une seule particule virale dans l’échantillon.

 

Effets des virus sur la synthèse macromoléculaire de la cellule hôte

De nombreux virus inhibent la synthèse de l’ARN, de l’ADN ou des protéines de la cellule hôte, afin de favoriser la production de protéines et d’acides nucléiques viraux. Les mécanismes moléculaires déployés dans ce but sont très divers, et varient selon le virus.
 

Effet cytopathogène (ECP)

La présence d’un virus provoque souvent des changements morphologiques chez la cellule hôte. Quand les modifications provoquées par l’infection sont visibles au microscope elles sont appelées, "l’effet cytopathogène" (ECP) du virus. Les ECP peuvent comprendre des phénomènes relativement mineurs, comme le gonflement, ou à l’inverse, le rétrécissement de la cellule; la formation de corps d’inclusion à l’intérieur de la cellule; ou des effets drastiques comme le détachement des cellules de la surface de la boîte de culture, la formation de syncytia multinucléés, ou même la mort cellulaire.
L’infection virale induit souvent la mort cellulaire programmée, ou apoptose, chez la cellule hôte. L’apoptose peut être considéré comme faisant partie de la défense antivirale de l’hôte, car la mort d’une cellule infectée avant la complétion du cycle de réplication virale empêchera la propagation de l’infection. En particulier, si une cellule infectée meurt pendant la phase d’éclipse, aucune particule virale infectieuse ne sera produite. Pour cette raison, plusieurs virus codent pour des protéines non-structurales qui inhibent ou retardent l’apoptose de la cellule infectée, afin de maximiser la production de particules virales. En contraste, les virus dont le relargage se fait par lyse de la cellule hôte peuvent provoquer la mort cellulaire à la fin du cycle de réplication, afin de favoriser la libération des particules virales.
L’ECP dépend à la fois du virus, et de la nature de la cellule infectée. Plusieurs virus provoquent des ECPs caractéristiques, qui constituent des éléments d’identification des virus présents dans des échantillons cliniques analysés aux laboratoires de virologie hospitaliers.
 

Points à retenir à propos de l'infection de différents types cellulaires par des virus

  Exprime le récepteur du virus? Possède la capacité de répliquer le virus Permet l'entrée et la réplication productive du virus
Cellule Permissive Peut-être OUI Peut-être
Cellule Susceptible OUI Peut-être Peut-être
Cellule Résistante NON Peut-être NON
Cellule Susceptible et Permissive OUI OUI OUI

 
 

Techniques de détection et de quantification des virus

Le seul moyen de visualiser les particules virales dans un échantillon clinique, ou dans des cellules infectées, est la microscopie électronique. Les autres techniques de détection et de quantification des virus dépendent de la détection
1) des protéines virales par immunochimie (ELISA, ou tests rapides sur bandelette), ou par hémagglutination
2) des acides nucléiques viraux par de la biologie moléculaire (PCR), ou
3) de la détection des effets provoqués par le virus sur des cellules susceptibles (détection d’un ECP sur cellules en culture, ou quantification du virus par plages de lyse).

Dans les deux premiers cas, les virus détectés peuvent être infectieux ou non-infectieux. Seule la troisième catégorie de techniques renseigne sur la présence des virus infectieux dans l’échantillon à analyser.


Quantification du titre infectieux par plages de lyse

Le titre infectieux d’un virus peut être déterminé par le dénombrement des plages de lyse formées sur un tapis cellulaire. Dans un premier temps, l’échantillon est ensemencé sur des cellules adhérentes en monocouche dans une boîte de culture. Après un temps d’incubation suffisant pour permettre l’attachement et l’entrée du virus (de l’ordre d’une heure), le milieu liquide est remplacé par un milieu semi-solide qui limite la diffusion des particules virales. Quand les cellules infectées au début de l’expérience sont tuées par l’ECP du virus, les particules virales qu’elles libèrent infectent seulement les cellules à proximité, qui seront ensuite tuées à leur tour. Après plusieurs cycles de réplication virale, les cellules mortes forment une plage de lyse, qui est visualisée après coloration par un produit qui marque des cellules vivantes. La plage de lyse apparaît comme une zone claire sur un fond coloré. Chaque plage de lyse représente une particule virale infectieuse présente dans l’échantillon initial.
Bien que cette technique soit applicable à de nombreux virus, les virus qui ne provoquent pas la mort de la cellule infectée ne vont pas forcément former des plages de lyse.
 

VIDEO

Rhinovirus -Cytopathic Effect - Hela Cells

Rhinovirus - Cytopathic Effect - MRC5 Cells

University of Leicester

 

WEB RESOURCES

Centers for Disease Control

Virusworld

 

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