x

ANGLISHT

 

BAKTERIOLOGJIA – KAPITULLI 2

KULTIVIMI DHE IDENTIFIKIMI I AGJENSËVE INFEKTIVË

Dr Alvin Fox
Professor Emeritus
University of South Carolina School of Medicine

Përktheu:

Dr. Lul Raka
Asistent i Mikrobiologjisë në Fakultetin e Mjekësisë të Universitetit të Prishtinës dhe Mikrobiolog në Departamentin e Mikrobiologjisë të Institutit Kombëtar të Shëndetësisë Publike të Kosovës- Prishtinë, Kosovë
 

PORTUGALISHT

SPANJOLLISHT

FARSI

VIDEO LIGJËRATATA
ANGLISHTE

E-MAIL DR LUL RAKA

Universiteti i Prishtinës

Logo image © Jeffrey Nelson, Rush University, Chicago, Illinois  and The MicrobeLibrary

FJALËT KYÇE

Izolimi (kultura)

pllakat e agarit / kolonitë
terrenet e lëngëta - epruvetat - madhësia

Identifikimi & taksonomia
    Familja 
      Gjinia
      Lloji 
      Tipi

Testet biokimike (fiziologjike)

Testet molekulare
      ADN-ADN homologjia
      sekuentimi 16S ARNr

Profilimi kimik

Polymerase chain reaction (PCR)
Aglutinimi (gjetja e antigjeneve)
Ngjyrosja
Serologjia (gjetja e antitrupave)

Sëmundjet ngjitëse shkaktohen nga baktere të ndryshme dhe shoqërohen me pasqyrë klinike dhe ecuri të ndryshme. Veçimi dhe identifikimi i baktereve nga mostrat klinike të pacientëve ndihmon në mjekimin e sëmundjeve. Ndërkaq, antibiogrami - testimi i ndjeshmërisë së mikrobeve ndaj antimikrobikëve (p.sh. përmes përcaktimit të përqëndrimit minimal inkibues ose PMI) mund të ndihmojë në përzgjedhjen e antibiotikut për terapinë medikamentoze. Nëse bakteret veçohen në rrethana dhe në vende të pazakonshme, atëherë kjo mund të sygjerojë për ndonjë shpërthim epidemik (psh. veçimi i tyre nga pajisjet dhe instrumentet e ndryshme mjekësore në spital); ose për mangësi në teknikat aseptike të personelit në atë repart.

Nëse dyshohet në një infeksion të shkaktuar nga bakteret, atëherë zakonisht preferohet veçimi i kolonive të dukshme të mikroorganizmit në kulturë të pastër (në terrene ushqyese me agar) dhe pastaj të bëhet identifikimi përfundimtar i llojit të bakteres që shkakton atë infeksion. Identifikimi bazohet në parimet e taksonomisë që zbatohen për gjendjen përkatëse klinike mikrobiologjike. Nga laboratori diagnostik kërkohet që brenda ditës të identifikohen shumë mikroorganizma dhe atë për një periudhë sa më të shkurtër kohore. Testet diagnostike që përdoren në laborator duhet t’i plotësojnë disa kritere: ato duhet të kryhen me lehtësi, të jenë sa më të shpejt dhe të kenë çmim të volitshëm.  Metodat klasike të identifikimit të baktereve bazohen në karakteristikat morfologjike dhe metabolike të tyre. Përzgjedhja e testeve diagnostike bëhet sipas aftësisë dalluese të mikrobeve të ndryshme. Për secilin mikroorganizëm që dëshirojmë ta identifikojmë ekzistojnë teste të ndryshe diagnostike. Tashmë, në laboratoret mikrobiologjike gjithnjë e më shumë janë në përdorim teknikat biologjike molekulare për karakterizimin e gjeneve specifike apo madje segmenteve të veçanta përbrenda gjeneve.

Figura 2. Procedura e ngjyrosjes sipas Gramit

Familja: një grup i gjinive të baktereve me veti të përafërta.

Gjinia: grup i llojeve të përafërta.

Lloji: grup i tipeve të përafërta.

Tipi: grup i nëntipeve të përafërta (p.sh. biotipi, serotipi).

Nëntipi (shtami): një linjë apo një izolat i llojit të caktuar të baktereve.

Më së shpeshti përdoret emri i llojeve bakterore (p.sh. Streptococcus pyogenes  - apo shkurt S.pyogenes). Gjithmonë ekzistojnë dy pjesë të emërtimit të llojeve: njëra e definon gjininë (në këtë rast "Streptococcus") dhe tjetra llojin (në këtë rast "pyogenes"). Emri i gjinisë gjithnjë shkruhet me shkronjë të madhe kurse lloji me shkronjë të vogël. Të dy emërtesat shkruhen të nënvizuar ose në stilin italik.

Ecuria e izolimit diagnostik dhe identifikimit të baktereve

Hapi 1. Mostrat e pacientit (p.sh. gjaku, urina, lëngu trunoshpinor etj.) kultivohen në pllakën me terren ushqyes. Pas inkubimit prej një apo disa ditësh, mund të vërehen koloni të veçuara të baktereve që mund të shihen me sy (Figura 1). Secila koloni e përmban miliona qeliza bakterore. Gjatë kësaj faze të identifikimit të baktereve rëndësi shumë të madhe ka vrojtimi i këtyre kolonive për të përcaktuar madhësinë, ndërtimin, ngjyrën si dhe hemolizën (nëse rriten në agar gjak). Një faktor tjetër i rëndësishëm në dallimin e mikroorganizmave është edhe kërkesa e tyre për oksigjen.

Hapi 2. Kolonitë ngjyrosen sipas Gramit dhe qelizat individuale bakterore vrojtohen me mikroskop.

FIGURA  3. SHEMBUJ TË NGJYROSJES SIPAS GRAMIT

   Bacillus brevis. Ngjyrosja sipas Gramit. CDC/Dr. William A. Clark 

  Streptococcus mutans. Ngjyrosja sipas Gramit. Në pllakat e agar gjakut vërehen forma sikur koke pa radhitje vargore. Këto mikrobe mund të shkaktojnë endokardit subakut bakterial dhe karies dental. CDC/Dr. R Facklam 

   Bacillus anthracis. Ngjyrosja sipas Gramit. CDC/Dr. James Feeley 

  Streptococcus mutans. Ngjyrosja sipas Gramit. Kultura nga tioglikolati. Gjatë kultivimit në bujon duken me formë shkopthore në varg. Mund të shkaktojnë endokardit subakut bakterial dhe karies dental. CDC/Dr. Richard Facklam 

NGJYROSJA SIPAS GRAMIT

Kolonia e baktereve thahet në xham mikroskopik dhe më tej procedohet si vijon (Figura 2 dhe 3):

Hapi 1. Ngjyrosja me kristal violet. Bakteret marrin ngjyrë të kaltër.

Hapi 2. Fiksimi me jod. Kjo procedurë e stabilizon ngjyrën kristal violete. Bakteret mbesin me ngjyrë të kaltër.

Hapi 3. Ekstraksioni me alkool apo me ndonjë tretës tjetër. Gjatë kësaj procedure disa baktere çngjyrosen (Gram negativet), por disa të tjera mbajnë të njejtën ngjyrë (Gram pozitivet).

Hapi 4. Ngjyrosja me safraninë. Bakteret Gram pozitive mbesin të kaltra, kurse bakteret Gram negative tashmë marrin ngjyrën e kuqe të safraninës.

Në vazhdim vrojtohen vetitë e baktereve me mikroskop. Pas vrojtimit, shtrohen këto pyetje: 

• A janë Gram-pozitive apo Gram-negative, bakteret e vërejtura? 
• Çfarë forme kanë ato - shkopthore, koke, spirale apo pleomorfe (formë e ndryshueshme)? 
• A janë të rradhitura veç e veç apo janë në çifte, vargje etj.? 
• Çfarë madhësie kanë qelizat bakterore të vërejtura? 

Përveç ngjyrosjes sipas Gramit, në praktikën laboratorike mikrobiologjike ndonjëherë përdoren edhe ngjyrosje të tjera (psh. ngjyrosja e sporeve dhe ajo e kapsulave).

Në vazhdim të ecurisë së diagnozës mikrobiologjike, merret një koloni tjetër e ngjashme e bakteres nga pllaka kultivuese dhe ekzaminohet për veçoritë biokimike; p.sh., a i fermenton sheqernat, siç është llaktoza? Në disa raste, bakteret identifikohen përmes antitrupave komercialë që reagojnë me antigjenet e caktuar sipërfaqësor të tyre (p.sh. përmes aglutinimit). Po ashtu, për diagnozën e infeksioneve bakterore, në përdorim të gjerë janë edhe shumë teste komerciale molekulare.

Karakterizimi taksonomik i baktereve

Edhe përbrenda vetë llojeve bakterore ekziston një ndryshueshmëri e konsiderueshme. Prandaj, krahasimi i llojeve bakterore përfshin krahasimin e shumë nëntipeve për secilin lloj. Këto krahasime bazohen kryesisht në analizat kimike dhe molekulare.

Analizat kimike

Për studimin e strukturës së baktereve janë në dispozicion pajisje të sofistikuara, që kryesisht mundësojnë profilimin e acideve të ngopura, karbohidrateve ose profilimin ubikuitar (të gjithanshëm). Në taksonominë e baktereve, ndihmesë mund të ofrojë edhe karakterizimi i prodhimeve të sekretuara të metabolizmit (psh. alkoolet e avullueshme dhe acidet yndyrore me vargje të shkurtëra).

Analizat molekulare 

Do të ishte ideale sikur të krahasoheshin sekuencat e tërë ADN-së kromozomale të baktereve. Por, kjo metodologji nuk është praktike, sepse për secilin nëntip të baktereve do të duhej bërë sekuentimi i miliona nukleotideve. Gjatë disa viteve të fundit  është arritur sekuentimi i tërë gjenomit të ndonjërit përfaqësues (psh. një nëntipi) të disa llojeve bakterore. Kjo procedurë kërkon një punë voluminoze nga ana e shumë grupeve kërkimore të dedikuara vetëm për sekuentim. Në të kaluarën, ngjashmëria gjenomike ndërmjet baktereve është vlerësuar përmes raportit të përmbajtjes së guaninës (G) plus citozinës (C), e cila zakonisht është shprehur si përqindje (%GC). Sot, zbatohen dy alternativa të tjera: hibridizimi dhe sekuentimi (më së shpeshti për gjenin që kodon ARNr 16S).

Për të krahasuar afërsinë gjenetike të nëntipeve të ndryshme të baktereve përdoret teknika e ADN-ADN homologjisë-d.m.th. me çfarë përputhshmërie dy shtame të ADN-së nga bakteret e ndryshme lidhen-hibridizohen së bashku. Nëse ADN-ja nga dy nëntipet bakterore tregon shkallë të lartë të homologjisë (d.m.th. vargjet lidhen mirë), atëherë konsiderohet se këto nëntipe i përkasin të njejtit lloj të baktereve. ADN-ja e llojeve të ndryshme bakterore nuk tregon homologji të strukturës gjenetike.

Gjatë viteve të fundit, sekuentimi i molekulave ribosomale të 16S ARNr është bërë “standard i artë” në taksonominë e baktereve. Kjo molekulë përafërsisht posedon 1600 nukleotide në varg. Sekuentimi i 16S ARNr jep përgjigje në vlerësimin e ngjashmërisë së gjenomeve mbi nivel të llojeve duke lejuar krahasimin e afërsisë përgjatë tërë mbretërisë së baktereve. Llojet e afërta bakterore shpesh kanë sekuenca identike të ARNr. Kjo teknikë ofron një informatë komplementare të hibridizimit ADN-ADN. Në laboratorin e mikrobiologjisë klinike, përcaktimi i sekuencës së gjeneve 16S ARNr dhe regjioneve të tjera gjenetike përdoret për identifikimin e nëntipeve të baktereve.

Diagnoza e shpejtë mikrobiologjike pa kultivim paraprak të mostrave klinike

Disa mikrobe patogjene që prekin njeriun (përfshirë shkaktarët e tuberkulozit, sëmundjes së Llajmit dhe sifilisit) nuk mund të rriten fare në terrene ushqyese ose rriten në sasi të pamjaftueshme. Veçimi i këtyre mikroorganizmave është i ngadalshëm, madje nganjëherë edhe i pamundshëm. Megjithatë, në praktikën laboratorike ekziston mundësia e zbulimit të baktereve nga mostrat klinike, pa i kultivuar ato fare në terrene ushqyese.

Një shembull i diagnozës së shpejtë, që përdoret në shumë ordinanca mjekësore është zbulimi i antigjeneve të streptokokut hemolitik të grupit A. Kjo realizohet duke marrë strisho nga gryka e pacientit dhe duke nxjerrë drejtpërdrejt nga mostra antigjenin streptokoksik (pa e kultivuar paraprakisht në terren ushqyes). Antigjeni bakteror zbulohet përmes fenomenit të përngjitjes (aglutinimit) së antigjenit me antitrupat e lidhur në kokërrzat komerciale të lateksit.

Sekuencat e ADN-së së njeriut mund të amplifikohen drejtpërdrejt nga lëngjet trupore të pacientit ( reaksioni zingjiror i polimerazës, PCR). Me këtë metodë mund të krijohen dhe veçohen sasi të mëdha të gjeneve specifike apo të pjesëve të tyre. Një qasje e tillë ka gjetur përdorim të madh në diagnozën e shpejtë të tuberkulozit.

Ndihmesë diagnostike në laboratorin e mikrobiologjisë mund të ofrojë edhe vrojtimi i drejtpërdrejtë mikroskopik i disa mostrave klinike të pacientit për praninë eventuale të baktereve – p.sh. vrojtimi mikroskopik i M.tuberculosis në këlbazë (baciloskopia).

BURIMET NË INTERNET 
Ngjyrosja sipas Gramit 
Univ. Texas Houston

Këshillimi për ngjyrosjen e Gramit
Microbe Library - William R. Mayberry

SLIDE SHOW
Imazhet e ngjyrosjes sipas Gramit-  bakteret e rëndësishme mjekësore 
Imazhet ndërrojnë automatikisht
Loyola Univ Med Ctr

ANIMACION 
Mësoni më shumë për PCR 
Biology Animation Library 
Kërkon Flash

UDHËZUES 
ID laboratori i baktereve
HHMI
Kërkon Flash

 

Kthehu në seksionin e Bakteriologjisë të Microbiology and Immunology On-line

 

Faqja e përditësuar më  Friday, August 15, 2014
Faqja mbahet nga  Richard Hunt